不同的滅菌方法使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生物必須具備以下特性：①菌種的耐受性應大于需滅菌產品中所有可能污染微生物的耐受性;②菌種應無致病性;③菌株應穩定。存活期長，易于保存;④易于培養。若使用休眠孢子，生物指示劑中休眠孢子含量要在90%以上。
(一)生物指示劑的制備
生物指示劑的制備應按一定的程序進行，制備前，需先確定所用微生物的特性，如D值(微生物的耐熱參數，系指一定溫度下，將微生物殺滅90%所需的時間，以分表示)等。菌株應用適宜的培養基進行培養。培養物應制成懸浮液，其中孢子的數量應占優勢，孢子應懸浮于無營養的液體中保存。
生物指示劑中包含一定數量的一種或多種孢子，可制成多種形式，通常是將一定數量的孢子附著在惰性的載體上，如濾紙條、玻片、不銹鋼、塑料制品等;孢子懸浮液也可密封于安瓿中;有的生物指示劑還配有培養基系統。生物指示劑應選用合適的材料包裝，并設定有效期。載體和包裝材料在保護生物指示劑不被污染和損耗的同時，還應保證滅菌劑穿透并能與生物指示劑充分接觸。載體和包裝應設計原則是便于貯存、運輸、取樣、轉移接種。
有些生物指示劑可直接將孢子接種至液體滅菌物或具有與其相似的物理和化學特性的替代品中。使用替代品時，應用數據證明二者的等效性。
(二)生物指示劑的應用
在滅菌程序的驗證中，盡管可通過滅菌過程某些參數的監控來評估滅菌效果，但生物指示劑的被殺滅程度，則是評價一個滅菌程序有效性最直觀的指標。可使用市售的標準生物指示劑，也可使用由日常生產污染菌監控中分離的最耐受微生物制備的孢子。
在生物指示劑驗證試驗中，需確定孢子在實際滅菌條件下的耐受性，并測定孢子的純度和數量。驗證時，生物指示劑的微生物用量應比日常檢出的微生物污染量大，耐受性強，以保證滅菌程序有更大的安全性。在最終滅菌法中，生物指示劑應放在滅菌柜的不同部位。并避免指示劑直接接觸到被滅菌物品。生物指示劑按設定的條件滅菌后取出，分別置培養基中培養，確定生物指示劑中的孢子是否被*殺滅。
過度殺滅產品滅菌驗證一般不考慮微生物污染水平，可采用市售的生物指示劑。對滅菌手段耐受性差的產品，設計滅菌程序時，根據經驗預計在該生產工藝中產品微生物污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和孢子數量。這類產品的無菌保證應通過監控每批滅菌前的微生物污染的數量、耐受性和滅菌程序驗證所獲得的數據進行評估。