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  在生命科學(xué)研究的廣闊領(lǐng)域中，解析基因?qū)Φ鞍踪|(zhì)功能的調(diào)控機(jī)制及蛋白質(zhì)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)是揭開生命活動本質(zhì)的核心環(huán)節(jié)。酵母單雜交（Yeast One-Hybrid, Y1H）、酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）及酵母三雜交（Yeast Three-Hybrid, Y3H）系統(tǒng)作為該領(lǐng)域的經(jīng)典研究工具，共同構(gòu)成了解析基因調(diào)控與生物分子互作的“利器組合”。

       酵母雜交技術(shù)的原理大多基于GAL4轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制，GAL4作為一種酵母轉(zhuǎn)錄因子，其核心功能是激活下游基因的轉(zhuǎn)錄過程。GAL4結(jié)構(gòu)上包含兩個關(guān)鍵功能域：一是位于N端1-147位氨基酸殘基區(qū)段的DNA結(jié)合域（DNA binding domain，BD），二是位于C端768-881位氨基酸殘基區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域（Activation domain，AD）。其中，BD能夠特異性識別并結(jié)合基因上游的激活序列UAS（Upstream-activating sequence）；而AD的作用則是啟動UAS下游基因的轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，BD與AD單獨(dú)存在時無法激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，只有當(dāng)二者在空間上實(shí)現(xiàn)充分接近并形成功能復(fù)合體時，才能共同激活UAS下游的啟動子，進(jìn)而促使啟動子下游的目標(biāo)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄。

圖1 轉(zhuǎn)錄因子GAL4

       麥克林提供各類實(shí)驗(yàn)用酵母雜交試劑，具有純度等級高、生產(chǎn)工藝先進(jìn)、支持研發(fā)定制等特點(diǎn)，能被廣泛適用于各類科研項(xiàng)目、研究實(shí)驗(yàn)中，歡迎選購。

       本文通過以下幾點(diǎn)介紹麥克林酵母雜交試劑的化學(xué)特性和相關(guān)應(yīng)用：

        1. 酵母雙雜交系統(tǒng)工作原理

        2. 酵母單雜交系統(tǒng)工作原理

        3. 酵母三雜交系統(tǒng)工作原理

        4. 麥克林酵母雜交試劑產(chǎn)品介紹

1. 酵母雙雜交系統(tǒng)工作原理

       酵母雙雜交技術(shù)是解析蛋白質(zhì)互作的核心工具，根據(jù)靶標(biāo)蛋白特性分為兩大關(guān)鍵系統(tǒng) —核系統(tǒng)與膜系統(tǒng)。

       核系統(tǒng)的工作原理主要基于GAL4的AD與BD作用特性。如圖2a所示，將目標(biāo)蛋白A、B的基因分別克隆至BD、AD載體上，通過酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)將構(gòu)建好的載體DNA-BD、DNA-AD轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞中，使酵母細(xì)胞表達(dá) A-BD 和 B-AD 融合蛋白。若 A 與 B 蛋白存在相互作用，二者在空間上會充分接近并形成功能復(fù)合體，可以重構(gòu) GAL4 的完整轉(zhuǎn)錄激活功能，進(jìn)而激活下游報告基因（如HIS3、ADE2等）的表達(dá)，最終通過觀察缺陷型培養(yǎng)基上酵母細(xì)胞的生長情況或顯色反應(yīng)，確定A、B蛋白是否存在相互作用。

       在膜系統(tǒng)酵母雙雜交體系中，由76個氨基酸殘基組成的泛素蛋白發(fā)揮著重要作用。如圖2b所示，高度保守的泛素被拆分為 C 端 Cub（融合轉(zhuǎn)錄因子 TF）和 N 端 NubG 兩個無獨(dú)立功能的片段，將蛋白A、B的基因分別克隆到Cub與Nub的表達(dá)載體上，并將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞，使酵母細(xì)胞分別表達(dá)出A-Cub-TF、B-NubG融合蛋白。當(dāng)?shù)鞍譇與B在細(xì)胞膜上發(fā)生相互作用時，會牽引Cub與NubG空間上靠近并重構(gòu)為完整泛素，泛素被泛素特異性蛋白酶（USP）識別剪切并釋放TF，TF進(jìn)入細(xì)胞核后激活報告基因的表達(dá)，從而使得該系統(tǒng)可以通過使用缺素培養(yǎng)基以及菌株是否變藍(lán)進(jìn)行陽性互作的篩選。

圖2 酵母雙雜交原理

2. 酵母單雜交系統(tǒng)工作原理

       酵母單雜交系統(tǒng)（Yeast One-Hybrid, Y1H）是在酵母雙雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，與酵母雙雜交相比，其核心差異在于不依賴 DNA 結(jié)合域（BD）的參與，是一種用于研究蛋白質(zhì)與特定 DNA 序列相互作用的技術(shù)。

       在 Y1H 實(shí)驗(yàn)體系中，將目標(biāo) DNA 序列（Bait，啟動子或增強(qiáng)子片段）整合至酵母細(xì)胞的報告基因上游區(qū)域；同時，候選蛋白A與激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合后，在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出A-AD融合蛋白。若候選蛋白質(zhì)與目標(biāo) DNA 序列發(fā)生特異性結(jié)合，便會激活報告基因表達(dá)，最終通過觀察缺陷型培養(yǎng)養(yǎng)上酵母細(xì)胞的生長情況或顯色反應(yīng)，確定DNA與蛋白間是否存在特異性結(jié)合。

圖3 酵母單雜交原理

3. 酵母三雜交系統(tǒng)工作原理

       酵母三雜交系統(tǒng)在酵母雙雜交系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，引入了能夠同時插入兩個外源蛋白的pBridge質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)時將蛋白A與蛋白Bait X的基因同時構(gòu)建到pBridge質(zhì)粒上，蛋白B基因構(gòu)建到AD質(zhì)粒上，通過酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞中，通過缺陷型平板上酵母細(xì)胞的生長狀態(tài)反映Bait X蛋白對其他兩種蛋白質(zhì)的作用方式。

        酵母三雜交可變性很強(qiáng)，Bait X可以通過多種方式參與互作：

        a)  若蛋白 A 與蛋白 B 不直接相互作用，Bait X 可作為 “橋梁” 促進(jìn)二者互作（如圖 4a）；

        b)  通過修飾其中一個蛋白，使原本不直接互作的 A、B 產(chǎn)生相互作用（如圖 4b）；

        c)  蛋白 A 與蛋白 B 可直接相互作用，Bait X 則可能發(fā)揮抑制作用，導(dǎo)致二者的互作減弱甚至完全終止（如圖 4c）。

圖4 酵母三雜交原理

4. 麥克林酵母雜交試劑產(chǎn)品介紹

       麥克林酵母雜交產(chǎn)品線秉持“精準(zhǔn)、高效、便捷”的核心定位，深度聚焦科研場景中的實(shí)際需求，包含酵母培養(yǎng)基、 DO Supplement 系列氨基酸缺失混合物、酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化試劑等，旨在為科研人員提供從載體構(gòu)建、菌株培養(yǎng)到篩選驗(yàn)證的一站式實(shí)驗(yàn)工具。

       借助麥克林 DO Supplement 系列氨基酸缺失混合物構(gòu)建營養(yǎng)缺陷篩選體系，并結(jié)合其酵母轉(zhuǎn)染試劑保障載體高效導(dǎo)入，對 Protein A 與 Protein B 的互作關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。如圖5所示，通過陰性對照（AD+BD、AD-Protein A+BD、AD+BD-Protein B）排除空載體互作和蛋白自身激活后，AD-Protein A 與 BD-Protein B 的組合在 SD/LTAH 平板上生長，證明Protein A 和 Protein B 存在相互作用。

圖5 麥克林酵母雙雜交實(shí)測圖

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