氮哌酮的危害及檢測目的
氮哌酮是一種丁酰苯類神經安定藥，動物使用后可消除緊張感，使其活動力下降，對環境淡漠并長期處于安靜狀態。有助于降低因應激及創傷引起的死亡率，因此在長途運輸中常常給豬等動物使用該藥。氮哌醇是氮哌酮在動物體內的代謝產物，與原藥氮哌酮的化學結構相近，是氮哌酮的殘留標示物。通過食物鏈氮哌酮及其代謝產物氮哌醇會對人體產生直接的危害。為此我國農業農村部和國家市場監督管理總局2019年發布的GB 31650-2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》中明確規定了氮哌酮及其殘留標示物氮哌醇在豬靶組織中的殘留限量。
本文闡述了如何將氮哌酮及其代謝物從樣品基質中分離提取出來，并經過凈化后，轉化成高效液相色譜可以檢測的形式。以提取、凈化為重點，依據國標GB 29709-2013，為檢測人員和相關領域研究人員提供一定的參考。
檢測項目：氮哌酮、氮哌醇
應用范圍：豬的肌肉、皮+脂、肝臟和腎臟
高效液相色譜法
方法原理：試樣中殘留的氮哌酮和氮哌醇用乙腈萃取，正己烷除脂，MCX柱凈化，高效液相色譜測定，外標法定量。
前處理儀器：
分析天平（感量0.01 g 和0.00001 g）；冷凍高速離心機；氮吹儀；旋渦混合器；固相萃取裝置；超聲波清洗機；均質機；離心管；濾膜（0.2 μm）。
檢測儀器：HPLC +PDA
樣品的制備與保存
取新鮮或冷凍空白組織、供試組織，去除筋膜，絞碎，并使均質。
取均質后的供試樣品，作為供試試料。
取均質后的空白樣品，作為空白試料。
取均質后的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液，作為空白添加試料。
試料于零下20 ℃ 以下保存。
前處理方法
1.提取
稱取試樣5 g±0.05 g，于離心管中，加乙腈10 mL，旋渦混合1 min，超聲2 min，5000 r/min離心5 min，取上清液，殘渣中加乙腈10 mL重復提取一次，合并兩次上清液。于40 ℃水浴旋轉蒸干。用2 %甲酸水溶液5 mL溶解殘余物，加正己烷4 mL，混勻，5000 r/min離心5 min，棄正己烷層液，備用。
2.凈化
MCX柱依次用甲醇3 mL、水3 mL和2 %甲酸水溶液3 mL活化，取備用液過柱，控制流速小于1 mL/min，用2 %甲酸水3 mL和甲醇3 mL淋洗，抽干，用5 %氨化甲醇4 mL洗脫。收集洗脫液，于40 ℃氮氣吹干，用流動相（乙腈-乙酸銨溶液1+1）1.0 mL溶解殘余物，旋渦混勻，供高效液相色譜法測定。
國標解讀及注意事項
1.氮哌酮和氮哌醇標準物質用甲醇配成1 mg/mL的標準儲備液，在零下20 ℃ 以下避光保存，有效期3 個月。
2.本方法使用乙腈兩次提取目標化合物，正己烷除脂，陽離子交換柱富集凈化，相當于5 g試料進行上機檢測。
3.MCX柱凈化方法為“酸上樣，堿洗脫”。
4.氨水甲醇溶液現用現配，避免氨水揮發，影響洗脫效果；洗脫過程中洗脫溶劑少量多次加入，可以增加洗脫率。
5.固相萃取過程中需要控制流速，使溶液一滴一滴地流下，以保證離子交換的效果。